Long Non-Coding RNAs como reguladores de procesos inmunitarios durante la infección por Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis y su posible uso como biomarcadores de diagnóstico

Gerard Badia Bringué¹, Victoria Asselstine², Ángela Cánovas², Marta Alonso-Hearn¹

(1)-NEIKER – Instituto Vasco de Investigacion y Desarrollo Agrario (2)-University of Guelph

La paratuberculosis bovina (PTB) es una enteritis granulomatosa crónica de rumiantes domésticos causada por Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP), que provoca pérdidas económicas muy importantes en el sector de vacuno lechero.  El control de la enfermedad se fundamenta en la aplicación de medidas higiénico-sanitarias en las explotaciones y en el diagnóstico y eliminación de animales infectados. Sin embargo, el diagnóstico de animales infectados con MAP está fuertemente condicionado por la falta de sensibilidad de las técnicas de diagnóstico disponibles sobre todo para la detección de animales subclínicos con lesiones focales en tejido intestinal. Esta limitación incide sobre la necesidad de desarrollar nuevas estrategias de control de la PTB que permitan la detección de animales con infección subclínica. Los RNAs no codificantes (ncRNAs) son moléculas de RNA que no se traducen en proteínas pero que están implicadas en la regulación de la expresión génica y juegan un papel muy relevante en la regulación de la respuesta inmune. Los ncRNAs largos (long non-coding RNAs, lncRNAs) son RNAs de más de 200 nucleótidos que se han asociados a la presencia y al pronóstico de varias enfermedades humanas, pero su anotación en vacuno de leche y el conocimiento de su interacción con mRNAs en los tejidos intestinales de los animales infectados naturalmente con MAP es muy limitado. Por ello, el objetivo de este estudio consiste en la identificación de lncRNAs (anotados y noveles) expresados en válvula ileocecal de vacas frisonas sin lesiones (N = 4), y con lesiones focales (N = 5) y difusas (N = 5) en tejidos intestinales usando la tecnología de secuenciación masiva de RNA (RNA-Seq). El análisis bioinformático se realizó usando la plataforma CLC Genomics Workbench. Las lecturas brutas se filtraron por calidad y se alinearon
al genoma de referencia de Bos taurus (ARS_UCD1.2.109) usando el método Large
Gap Read Mapping (LGRM). Este tipo de alineamiento permite alinear secuencias que contienen deleciones muy grandes sin la necesidad de que el genoma esté anotado, por lo que facilita el descubrimiento de lncRNAs noveles. Posterior al alineamiento y para identificar los lncRNAs noveles se empleó la herramienta FlExible Extraction of lncRNAs (FEELnc), El flujo de trabajo del FEELnc se divide en tres partes: primero, se eliminan los tránscritos de menos de 200 nucleótidos, después se seleccionan los tránscritos no codificantes, y finalmente éstos se clasifican según su posición y el RNA con el que interaccionan. 

La anotación resultante identificó un total de 1434 lncRNAs, 899 de ellos noveles. A continuación, se realizó el análisis de expresión diferencial con la librería de R DESeq2, identificando un total de 8 lncRNAs diferencialmente expresados, 5 de ellos no anotados, por los que se los podría considerar noveles. Cuatro de los cinco lncRNA noveles tenían por lo menos homología parcial con al menos un ncRNA anotado de mamíferos. La homología entre los lncRNA noveles y sus homólogos en otras especies tomaban valores entre el 80% y el 3%, lo cual es consistente con el hecho que los lncRNAs suelen mostrar bajos grados de conservación. Concretamente, se identificaron 1, 6 y 2 lncRNAs diferencialmente expresados en las comparaciones de vacas con lesiones focales vs
controles, con lesiones difusas vs controles, y con lesiones difusas vs focales, respectivamente.  Se identificaron correlaciones significativas entre la expresión de los lncRNAs lncRNA1086.1, lncRNA
ENSBTAG00000050406, lncRNA_2340.1 y la de los genes Inactive
Phosphatidylinositol 3-Phosphatase 9 (MTMR9),
GM
Domain Family member B (RGMB) y homeobox A6 (HOXA6),
respectivamente. El gen MTMR9 regula negativamente la apoptosis, el gen RGMB
inhibe la expresión de la interleukina 6, y el gen HOXA6 regula la diferenciación celular y la inflamación. Adicionalmente, se realizó un análisis de enriquecimiento de regiones genéticas (qualitative trait loci (QTLs) para identificar a qué caracteres estaban asociados las regiones en las que se localizaban los lncRNAs diferencialmente expresados. Los resultados mostraron que los lncRNAs se encontraban en regiones genómicas previamente asociadas a mamitis clínica, colesterol HDL, y susceptibilidad a la tuberculosis, PTB y leucosis bovina. Los resultados de este estudio son útiles para el conocer la regulación de la respuesta inmune del hospedador en las diferentes fases de la infección, y demostrar que los lncRNAs son moléculas importantes en la válvula ileocecal, el sitio de infección primario de MAP. Los lncRNAs identificados en este estudio también podrían permitir el desarrollo de nuevas técnicas de diagnóstico de la PTB basadas en su detección.

Financiación:

RTI2018-094192-R-C21 y PID2021-122197OR-C21 financiados por AEI/10.13039/501100011033 y FEDER, “una manera de hacer Europa”.