Identificación de biomarcadores diferencialmente expresados en sangre y tejidos intestinales de vacas Frisonas naturalmente infectadas por Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis y con lesiones multifocales
Arrate Prado López1, Gerard Badia Bringué1, Rosa Casais 2, Marta Alonso Hearn1
(1)-NEIKER – Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario, Basque Research and Technology Alliance (BRTA) (2)-SERIDA, Centro de Biotecnología Animal
La
Paratuberculosis bovina (PTB) es una enteritis granulomatosa crónica que
provoca pérdidas económicas importantes en vacuno de leche y que está causada
por Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP). El control
de la enfermedad se basa en la instauración de medidas higiénico-sanitarias en
las explotaciones y en la identificación y eliminación de animales infectados.
Sin embargo, los métodos diagnósticos actuales, ELISA y PCR fecal, presentan baja
sensibilidad para la detección de animales en estadios subclínicos. Por ello,
es necesario desarrollar nuevos métodos diagnósticos que permitan identificar
animales subclínicos o resilientes a la infección por MAP. Estudios previos
realizados en nuestro grupo permitieron identificar regiones genéticas y
diversos genes y rutas asociadas a la presencia de lesiones de tipo multifocal
(Canive et al., 2021). Concretamente, se observó un enriquecimiento
significativo de la ruta de queratinización. Las citoqueratinas podrían tener
un papel importante en animales con lesiones de tipo multifocal manteniendo la
estabilidad e integridad del epitelio intestinal, y regulando funciones como la
proliferación celular, migración, así como las respuestas inflamatorias e
inmunes. Más recientemente se ha observado sobreexpresión del factor de
transcripción EGR4 (early growth response factor 4) y su
asociación con la presencia de lesiones multifocales (Badia-Bringué et al.,
2023). La sobreexpresión del EGR4 frenaría la respuesta inmune
proinflamatoria mediada por NF-Æ˜ß en respuesta a la infección por MAP y
restringiría el daño tisular. Teniendo en cuenta los estudios citados, surge la
hipótesis de que la formación de granulomas multifocales podría constituir un
mecanismo de resiliencia a la PTB, al favorecer el control de una respuesta
inmune proinflamatoria aberrante y la progresión de las lesiones a formas
difusas más severas. En el presente estudio se propone la búsqueda e
identificación de biomarcadores asociados a animales con lesiones multifocales
mediante la tecnología de secuenciación masiva del RNA (RNA-Seq).
El
estudio se realizó con muestras de sangre, yeyuno y ganglio yeyunal caudal de
11 vacas con lesiones multifocales y 4 sin lesiones visibles en tejido
intestinal. Las muestras de tejido se conservaron en RNAlater® a -80ºC. El RNA
se purificó con el RNeasy Mini Kit siguiendo las instrucciones del fabricante.
La sangre se recogió en tubos PAxgene Blood RNA y se extrajo el RNA con el kit
PAXgene blood RNA kit. El DNA residual se eliminó mediante digestión con
RNase-free DNase I Amplification Grade. La concentración y calidad del RNA
obtenido se midió con el Agilent Bioanalizer 2100 y se seleccionaron para
realizar el RNA-Seq únicamente las muestras de RNA con un valor RIN ≥ 7. Cada
librería de RNA se preparó con aproximadamente 250 ng de RNA mediante el
Illumina NEBNext Ultra Directional RNA library preparation kit y su calidad de
comprobó en el Agilent Bioanalizer empleando un chip de DNA de alta
sensibilidad para confirmar que el tamaño de los insertos era de entre 188-274
pb. Las librerías fueron secuenciadas mediante secuenciación single-end
en formato 1×100 con el secuenciador Illumina Novaseq. La media de lecturas
brutas totales fue de 33,38, 33,86, y 36,92 millones en muestras de sangre,
yeyuno y ganglio, respectivamente. Las lecturas brutas se filtraron mediante un
control de calidad con FastQC y Trimmomatic y se alinearon con el
genoma de referencia de Bos taurus (ARS_UCD1.3.113) con STAR. La
anotación y el conteo de lecturas se realizó con Rsubread y la
normalización y el análisis de expresión diferencial con DESeq2. El
análisis funcional para búsqueda de ontologías génicas y rutas metabólicas
enriquecidas se realizó con la librería de R ClusterProfiler.
En
general, se detectaron más genes infraexpresados que sobreexpresados en los
tres tipos de muestra de animales con lesiones multifocales vs. sin
lesiones. En sangre se identificaron 1.611 genes diferencialmente expresados,
de los cuales 610 estaban sobreexpresados y 1.001 infraexpresados, y se
asociaban a procesos de traducción (bta:03010) e infecciones víricas
(bta:05171). En yeyuno se identificaron
7 genes diferencialmente expresados asociados a migración de células
inmunitarias (GO:1990266, GO:0097530, GO0097529, GO0050900), y activación de
IL-17 (bta:04657). El gen glycoprotein 2 (GP2) fue el más
sobreexpresado en yeyuno de animales con lesiones multifocales vs. controles (log2
fold change = 6,94). Este gen codifica una proteína integral de membrana
que se une a patógenos, desempeñando un papel importante en la respuesta inmune
innata. En ganglio se identificaron 12 genes diferencialmente expresados
asociados a ontologías génicas relacionadas con la regulación de TOR, una
proteína kinasa implicada en respuestas celulares frente al daño al DNA y a la
privación de nutrientes. La sobreexpresión de los biomarcadores
diferencialmente expresados en vacas con lesiones multifocales vs.
controles está siendo validada mediante ELISA y RT-qPCR
Los
biomarcadores identificados en el presente estudio podrían contribuir a la
mejora de las herramientas disponibles para la detección de ganado vacuno
resiliente a la PTB.
RTI2018-094192-R-C21
y PID2021-122197OR-C21 financiados por AEI/10.13039/501100011033 y FEDER, “una
manera de hacer Europa”. Arrate Prado es beneficiaria de un contrato
predoctoral (Programa IKERTALENT 2024, código 1029112).
