Comparación del rendimiento diagnóstico de la qPCR y cultivo microbiológico para la detección de Prototheca spp. en muestras de leche.

JOSE MANUEL DIAZ CAO¹, Gonzalo López-Lorenzo¹, María Belén Hernández-Garabal¹, Laura Junquera¹, Alberto Rodríguez-Lozano¹, Cynthia López-Novo¹, Susana Remesar-Alonso¹, Néstor Martínez-Calabuig¹, Ceferino Manuel López¹, Gonzalo Fernández¹, Alberto Prieto-Lago¹

(1)-UNIVERSIDADE DE SANTIAGO DE COMPOSTELA

En la última década, la epidemiología de la mamitis bovina ha evolucionado significativamente [1]. Patógenos clásicos com Staphylococcus aureus o Streptococcus agalactiae están bajo relativo control, la prevalencia de otros patógenos como las algas del género Prototheca han aumentado [2]. La mamitis prototecal está causada principalmente por Prototheca bovis (anteriormente P. zopfii genotipo 2), Prototheca blaschkeae y Prototheca ciferri; y puede tener un elevado impacto económico y clínico produciendo una reducción drástica de la producción lechera, un aumento sostenido de las células somáticas (RCS), y a menudo la pérdida funcional del cuartón afectado [3].

Prototheca spp. son algas unicelulares saprófitas, no fotosintéticas que colonizan nichos húmedos como suelos, camas, lodos y sistemas de efluentes [4]. Su comportamiento epidemiológico es dual: son patógenos ambientales donde el entorno es el reservorio primario, pero son contagiosos durante el ordeño. Sin tratamiento eficaz, el control se centra en la detección precoz, la vigilancia proactiva y el sacrificio selectivo. Esto hace que sea muy necesario contar con medios de diagnóstico capaces de detectar correctamente a los animales portadores.

El cultivo microbiológico es el Gold Standard, pero presenta limitaciones debidas al sobrecrecimiento bacteriano que enmascara la presencia de Prototheca spp. o por baja sensibilidad en infecciones subclínicas. En este sentido, la PCR cuantitativa (qPCR) es una alternativa diagnóstica más rápida pero pocas veces ha sido validada en condiciones de campo. Por tanto, en este estudio, nuestro objetivo fue evaluar la aplicación de una qPCR comercial en comparación con el cultivo microbiológico para la detección de Prototheca spp. en muestras de leche.

Se analizó un panel de 88 muestras de leche de cuartones individuales suministradas por el Laboratorio Interprofesional Galego de Analise de Leite (LIGAL) (60 positivas y 28 negativas; procedentes de explotaciones con historial conocido a infecciones con Prototheca spp.). Asimismo, se analizaron 29 muestras de tanques de leche negativas a Prototheca spp. en cultivo, pero procedentes de granjas con historial de infección con vacas positivas. Todas las muestras habían sido previamente identificadas mediante cultivo microbiológico e identificación mediante MALDI-TOF. Para la qPCR, se empleó un kit comercial. Se calculó la sensibilidad, especificidad y concordancia (índice Kappa de Cohen.)

En muestras individuales, la qPCR mostró una sensibilidad y especificidad del 100 % respecto a la identificación confirmada por MALDI-TOF, con un acuerdo perfecto con la qPCR (kappa = 1). En las muestras de tanque, la qPCR detectó la presencia de ADN de Prototheca spp. en el 75,86% (22/29) de ellas. Los resultados de este estudio señalan un mejor rendimiento de la qPCR frente al cultivo en muestras de leche. Pese a la concordancia absoluta en muestras individuales, la qPCR mejoró mucho la detección en tanque, detectando al patógeno en granjas con cultivo negativo al tanque. Esta discrepancia podría explicarse por la presencia de cargas genómicas bajo el umbral de detección microbiológico, situación característica de escenarios de baja prevalencia, infecciones incipientes o niveles bajos de contaminación ambiental donde el efecto de dilución en tanque enmascara la presencia del alga.

Debe considerarse que un positivo en tanque no implica necesariamente infección intramamaria en el rebaño, dada la posible presencia del alga en numerosos lugares de la explotación [2,4]. No obstante, sirve como un screening para realizar una investigación individualizada. La mayor sensibilidad de la qPCR en esta muestra facilita la detección precoz, un factor determinante para el control de la prototecosis bovina, que junto a la segregación estricta de las vacas positivas a Prototheca spp., y a cambios en el manejo higio-sanitarios, son estrategias clave para el control y erradicación [5]. En conclusión, la aplicación de la qPCR en muestras de leche para detección de Prototheca spp. es una herramienta con buen rendimiento diagóstico y con mayor capacidad para detectar positivos en tanque de leche que el cultivo microbiológico. Su aplicación en el diagnóstico de mamitis debería mejorar la capacidad de control precoz y así reducir la diseminación del patógeno, minimizando su impacto económico y evitando el sacrificio innecesario de animales, mientras garantiza que la circulación del patógeno no pase desapercibida.

[1] Fernández, G. et al., 2013. Vet Res Commun. https://doi.org/10.1007/s11259-013-9570-1

[2] Jagielski, T. et al., 2019. J Dairy Sci. https://doi.org/10.3168/jds.2018-15495

[3] Janosi, S. et al., 2000. Vet. Q. https://doi.org/10.1080/01652176.2001.9695082

[4] Marques, S. et al., 2006. J. Dairy Sci. https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(06)72465-1

[5] Beinhauerová, M. et al., 2023. Animals. https://doi.org/10.3390/microbiolres14030091