Desarrollo de una nueva qPCR para estimar la carga bacteriana del complejo Mycobacterium tuberculosis en tejidos animales
Leire Fernández Veiga1, David Sánchez Martel1, María V. Geijo1, Ramón A Juste1, Joseba M. Garrido Urkullu1, Iker Agirregomoskorta Sevilla1
(1)-NEIKER-Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario, Basque Research and Technology Alliance (BRTA)
La
tuberculosis animal es una enfermedad zoonótica presente en animales domésticos
y silvestres que está causada por bacterias del complejo Mycobacterium
tuberculosis (CMT), siendo M. bovis y M. caprae las especies
más relevantes en Europa. La enfermedad ejerce un gran impacto económico, tanto
por las pérdidas generadas a causa de la disminución en la productividad y el
incremento de la mortalidad, como por el gasto que conlleva la propia
aplicación de los programas de erradicación obligatorios. El cultivo (e
identificación del aislamiento) ha sido el método oficial para la confirmación
de la infección en animales con pruebas in vivo positivas o en muestras
sospechosas detectadas en el matadero, pero en la actualidad el Programa
Nacional de Erradicación de la Tuberculosis Bovina también contempla la PCR
directa para tal fin. La gran virtud de la PCR es que ofrece resultados en
pocas horas en comparación con las semanas o incluso meses que requiere el
cultivo. Otra de sus ventajas, es que permite estimar la carga bacteriana (en
forma de equivalentes genómicos o EG) de forma más rápida y menos laboriosa que
el cultivo (en forma de unidades formadoras de colonia o UFC). La
cuantificación de la carga en las muestras no es un requerimiento oficial, pero
proporciona una valiosa información y resulta muy útil en estudios con animales
de experimentación.
En
este trabajo, desarrollamos un ensayo de qPCR que amplifica una secuencia del
sistema regulador devR-devS, específica de los miembros del CMT, para su
cuantificación directa en muestras de tejido. Se trata de una diana de copia
única por bacteria, por lo que la cuantificación es mucho más precisa que
cuando se utilizan secuencias multicopia presentes en número variable
dependiendo de la cepa (como IS6110). El nuevo ensayo de qPCR
desarrollado fue evaluado mediante varios criterios para determinar su utilidad
como herramienta diagnóstica en tuberculosis animal. Por un lado, evaluamos la
especificidad analítica utilizando un panel de cepas que incluía representantes
del CMT, micobacterias no tuberculosas y otros microorganismos, demostrando ser
específico para CMT con un 100% de inclusividad (todas las CMT positivas) y
exclusividad (todas las de fuera del CMT negativas). Se emplearon curvas
estándar generadas con fragmentos sintéticos de DNA (gBlocks, IDT) que
contienen la secuencia detectada por la qPCR y también con DNA extraído de M.
bovis BCG Danish para establecer una cuantificación absoluta con un rango
dinámico de entre 10⁶ y 1 copia de gBlocks o genomas de BCG por reacción. La
sensibilidad analítica, calculada como el límite de detección con un 95 % de
confianza (LOD95), fue de 2 copias de gBlocks y de 2 genomas BCG por reacción. Se
analizaron 150 muestras de campo para evaluar el rendimiento del ensayo: 100
muestras negativas de ganado bovino obtenidas en el matadero y 50 muestras
positivas compuestas por tejidos de ganado bovino y caprino previamente
caracterizados. Los resultados del nuevo ensayo se compararon con los obtenidos
mediante una qPCR basada en el gen multicopia IS6110 y el cultivo automático
en BACTEC MGIT 960. Todas las muestras positivas y negativas fueron
correctamente identificadas por la nueva qPCR, mostrando una sensibilidad y
especificidad del 100 %. Para estudiar la correlación entre UFCs y EGs, se
procesaron 224 muestras de tejidos de animales experimentalmente infectados
(ratones, cabras y tejones). Éstas fueron procesadas mediante cultivo (en placa)
de diluciones seriadas para estimar la carga de UFCs y la extracción de DNA y
qPCR devR-devS para estimar la carga de EGs. La correlación de Pearson general
entre los datos de UFC y EG estimados fue de 0,79, variando entre 0,61 y 0,93
según el tejido y la especie animal. También se calculó la concordancia entre
los resultados positivos/negativos obtenidos mediante el cultivo y la qPCR
utilizando el total de muestras analizadas. El coeficiente kappa obtenido fue de
0,82, indicando una muy buena concordancia entre ambos métodos.
En
conclusión, el ensayo de qPCR desarrollado se presenta como una prometedora herramienta
de diagnóstico de la tuberculosis animal, capaz de cuantificar muy rápidamente
la carga bacteriana incluso en muestras con bajos niveles de infección. Su uso puede
ser especialmente útil en la confirmación de animales positivos o sospechosos,
así como en estudios donde estimar la carga bacteriana es esencial (p. ej. ensayos
de vacunación).
Financiación:
Proyectos EFA115/01 INNOTUB II financiado por el Programa
INTERREG-POCTEFA 2021-2027 de la UE y Proyecto PID2022-142939OR-C21 financiado
por MICIU/AEI /10.13039/501100011033 y por FEDER, UE. Leire Fernández obtuvo
una beca del Programa Ikertalent 2021 del Departamento de Desarrollo Económico,
Sostenibilidad y Medio Ambiente del Gobierno Vasco. David Sánchez-Martel obtuvo
una beca PREP2022-000469 financiada por MICIU/AEI /10.13039/501100011033 y por
el FSE+.
