Análisis transcriptómico de sangre periférica de vacas frisonas subclínicas naturalmente infectadas con Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis identifica respuestas inmunitarias innatas sistémicas e inhibición de traducción

Arrate Prado López¹, Gerard Badia-Bringué¹, Rosana Torremocha², Alejandra Isabel Navarro-León³, Rosa Casais³, Marta Alonso-Hearn¹

(1)-Departamento de Ciencia Animal, NEIKER-Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario, Derio, Bizkaia, España (2)-Parque Científico de Madrid, Unidad Genómica, Campus de Cantoblanco, Madrid, España (3)-Centro de Biotecnología Animal, Servicio Regional de Investigación y Desarrollo Agrario (SERIDA), Deva, Asturias, España

La paratuberculosis bovina (PTB), causada por Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP), es una enfermedad intestinal granulomatosa crónica que provoca importantes pérdidas económicas en la industria láctea a nivel mundial. Las pruebas diagnósticas disponibles presentan una sensibilidad limitada, ya que permiten detectar de forma fiable únicamente a los animales en fases avanzadas de la enfermedad, pero no a aquellos que se encuentran en estadios tempranas o subclínicas, caracterizados por la presencia de lesiones focales o multifocales en los tejidos intestinales. Estudios previos han sugerido que los granulomas multifocales podrían limitar la progresión de las lesiones intestinales; sin embargo, los mecanismos moleculares implicados en el establecimiento y mantenimiento de la infección crónica por MAP no se conocen completamente. El objetivo de este estudio fue comparar los perfiles transcriptómicos globales de muestras de sangre periféricas (PB) de vacas frisonas con lesiones multifocales y de animales sin lesiones en tejidos intestinales, con el fin de identificar biomarcadores que permitan el desarrollo de nuevos métodos diagnósticos más sensibles para la detección de vacas con lesiones multifocales y en estadios subclínicos de PTB.

Se extrajo RNA total a partir de muestras de PB de 11 vacas con lesiones multifocales y 4 animales sin lesiones visibles en tejido intestinal. Las librerías de ARN se prepararon utilizando el kit Illumina NEBNext® Ultra y se secuenciaron mediante secuenciación single-end (1x100bp) en un secuenciador Illumina NextSeq. Las lecturas brutas se filtraron utilizando Prinseq-lite 0.20.4 y se alinearon con el genoma de referencia Bos taurus (ARS_UCD2.0) utilizando STAR 2.7.0a. La anotación de las lecturas se realizó con el paquete Rsubread, mientras que la normalización de los datos y el análisis de expresión diferencial se llevaron a cabo utilizando DESeq2. El análisis funcional para la identificación de ontologías génicas y rutas metabólicas enriquecidas se realizó con ClusterProfiler. El análisis de interacción proteína-proteína (IPP) se realizó empleando los genes diferencialmente expresados con un cambio en la expresión (fold change) ≥ 2 o ≤ 2, con STRING 12.0 y Cytoscape 3.10.3. Dado que el gen estimulado por interferón (ISG15) estaba significativamente sobreexpresado (fold change = 2,42) en vacas con lesiones multifocales frente a los controles, y que en la red IPP interaccionaba con distintos clústeres, lo que sugiere un papel regulador clave en los cambios transcripcionales observados, se evaluó su potencial como biomarcador. La validación de la sobreexpresión del mRNA del ISG15 se realizó mediante RT-qPCR, empleando el gen endógeno Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como control. La cuantificación de ISG15 en muestras de plasma de animales con lesiones multifocales (N=25) y animales sin lesiones y con resultados negativos en las pruebas diagnósticas (N=18) se realizó mediante un ELISA sándwich competitivo.
Resultados
De media se obtuvieron 34,08 millones de lecturas brutas en las muestras de PB. Al comparar vacas con lesiones multifocales frente a los controles, se identificaron un total de 1.272 genes diferencialmente expresados, asociados principalmente a procesos biológicos relacionados con la traducción, el splicing, el procesamiento de mRNA, la biogénesis de complejos ribonucleoproteicos y el catabolismo de proteínas. El análisis de rutas metabólicas reveló el enriquecimiento de cuatro rutas en las muestras de PB de vacas con lesiones multifocales en comparación con los controles: ribosomas, COVID-19, termogénesis y la enfermedad de Parkinson. El análisis IPP identificó una red compuesta por 17 genes infraexpresados que codifican proteínas ribosomales (ribosomal proteins, RPs) asociadas a procesos de traducción. Esta red interaccionaba funcionalmente con la ribonucleoproteína nuclear pequeña F (SNRPF), implicada en el ensamblaje del snRNP del espliceosoma, lo que sugiere una inhibición coordinada de los procesos de traducción y splicing en los animales con lesiones multifocales. Se observaron asociaciones funcionales entre cuatro genes sobreexpresados implicados en la activación de la respuesta inmunitaria innata: ISG15; un activador dependiente del ADN de los factores reguladores del IFN (ZBP1); la helicasa DExH-Box 58 (DHX58) y la 2′-5′-oligoadenilato sintetasa 1 (OAS1Y). Los resultados de RT-qPCR confirmaron la sobreexpresión del ARNm del gen ISG15 en vacas con lesiones multifocales frente a los controles (fold change = 1.93; P-valor = 0.03), observándose una clara correlación entre los resultados obtenidos mediante RT-qPCR y RNA-Seq (r Pearson = 0,98; P-valor =1,67 × 10⁻¹¹). Los resultados del ELISA sándwich cuantitativo mostraron que las vacas con lesiones multifocales presentaban niveles medios de proteína ISG15 superiores a los observados en los animales control (656,85 pmol/μl frente a 575,29 pmol/μl, respectivamente); sin embargo, esta diferencia no alcanzó significación estadística (P-valor = 0,69)

Este estudio ofrece la primera comparación transcriptómica de la sangre periférica de ganado bovino infectado naturalmente por MAP con lesiones multifocales vs. controles. Los resultados sugieren la existencia de un complejo equilibrio entre la activación y regulación de la inmunidad innata del huésped, la reprogramación de la traducción y la adaptación metabólica en vacas con lesiones multifocales. Se identificaron posibles biomarcadores para desarrollar nuevos métodos de detección de animales con lesiones multifocales en estadios subclínicos de la PTB.