SECUENCIACIÓN MASIVA PARA CONOCER LA MICROBIOTA EN EL AGUA DE BEBIDA

JUAN JOSÉ GARCÍA GARCIA¹, ALBERTO BENITO DÍAZ², PATRICIA GÓNZALEZ GARCIA³, ALVARO CAÑETE REYES⁴, MARTA HERNÁNDEZ PÉREZ⁵

1-itacyl 2-ITACYL
3-ITACYL 4-ITACYL
5-ITACYL

OBJETIVOS

El objetivo del presente estudio
consistió en la identificación y cuantificación de la comunidad microbiana
interna presente en el agua de bebida de las explotaciones de vacuno extensivo
en el ecosistema adehesado de la provincia de Salamanca, utilizando la
secuenciación masiva de amplicones del ADNr16S.

MATERIAL Y MÉTODOS

Se han tomado muestras de agua en
21 abrevaderos de diferentes explotaciones de vacuno de carne en régimen
extensivo en la provincia de Salamanca. Se han recogido en recipientes
estériles de un litro.

Para la extracción del ADN se centrifugó
cada muestra a 24000 rpm, durante 30 minutos a 4ºC, mediante una
ultracentrífuga Avanti J-30I (Bekman Coulter). Obteniendo un pellet que
contendrá toda la masa microbiana contenida en la muestra de agua.

A partir del pellet obtenido se
realizó la extracción de ADN, de acuerdo a las instrucciones del Kit DNeasy
PowerFoof Microbial Kit (Qiagen, Germany) y la concentración de ADN se
determinó mediante un Fluorímetro Qubit 4 (Invi- trogen).

La diversidad microbiana fue
estudiada por secuenciación de la región V3-V4 amplificada del gen 16S rRNA
usando los cebadores y condiciones de PCR descritos por Klindworth y col.
(2013). La multiplexación de muestras, la purificación de bibliotecas y la
secuenciación fueron llevadas a cabo como se describe en la “Biblioteca de
secuenciación metagenómica 16S. Guía de preparación” de Illumina. Las muestras
se secuenciaron mediante la tecnología por síntesis en paralelo en una plataforma
MiSeq usando el 2×300 cycle V3 Kit siguiendo los protocolos de secuenciación de
Illumina.

Bioinformática y análisis de
datos

Para el análisis de 16S ARNr
(microbiota) secuenciado, en primer lugar, se usó el paquete DADA2 (Callahan y
col., 2016) incluido dentro del software QIIME 2 (Bolyen y col., 2018). Como re
sultado se obtuvo una tabla con las secuencias idénticas agrupadas en variantes
Amplicon Sequence Variants (ASVs) y, se utilizó un clasificador Bayesiano naive
basado en machine learning (Wang y col., 2007) para realizar la asignación
taxonómica de los ASVs utilizando la base de datos de SILVA (Quast y col.,
2013) como referencia.

Se evaluó la beta diversidad
mediante el análisis de Coordenadas Principales (PCoA) usando las distancias de
Bray-Curtis. Por último, la composición bacteriana de las muestras fue
expresada como abundancia relativa y representada en gráficos de barras a nivel
de filo y a nivel de género considerando los 20 más abundantes.

RESULTADOS

Hasta el momento en la mayoría de
los trabajos, la determinación de los microorganismos presentes en el agua de
bebida, que se encuentra a disposición de los animales, se han realizado
utilizando métodos microbiológicos tradicionales dependientes de cultivo. Sin
embargo, la mayoría de los microorganismos observables en la naturaleza no se
cultivan mediante estas técnicas, por ello estos métodos presentan limitaciones
y se ha demostrado que no son confiables para la caracterización microbiana
completa de muchos ecosistemas, incluidos los de los alimentos (Pires y col.,
2019).

Una alternativa para estudiar
este amplio porcentaje de comunidades microbianas que ha permanecido fuera del
alcance de la investigación durante años es la secuenciación masiva (Hernández
y col., 2020). Estas técnicas permiten llevar a cabo la caracterización de la
composición taxonómica de un alimento, así como la determinación de la
abundancia relativa de las comunidades microbianas eludiendo el requisito
previo del cultivo y la identificación de las especies presentes a posteriori.

No hay un predominio claro de
unos grupos bacterianos sobre otros, presentando una alta diversidad. La
mayoría de géneros identificados son los típicos del agua y del plancton: Cyanobium, Verrumicrobiae, Comamonadaceae,
Oxalobacteriacea, Polynucleobacter etc.. Aunque se han encontramos géneros
con mayor potencial patógeno entre los grupos más abundantes cómo Mycobacterium y Aeromonas. En dos de los
puntos se ha identificado el género Hidrogenophaga,
muy característico de aguas

CONCLUSION

El presente trabajo demuestra que
la aplicación de técnicas independientes de cultivo como la secuenciación
masiva permite aumentar el conocimiento de la diversidad de especies presentes
en la comunidad microbiana del agua de bebida frente a la proporcionada por los
métodos microbiológicos tradicionales. Los resultados obtenidos permiten
indicar que la microbiota del agua de bebida presenta una alta biodiversidad,
lo que indica una buena calidad. En general, los géneros que predominan en
abundancia son los habituales en el agua y en el plancton. Cabe resaltar la
presencia de géneros con alto potencial patógenos como Mycobacterium y Aeromonas.