Microbiota y mamitis en el ganado bovino lechero: relación entre la comunidad bacteriana de la leche y el estado sanitario de la ubre

La mamitis es una de las principales enfermedades que afectan al ganado bovino lechero. Pese a que puede estar producida por múltiples factores (físicos, químicos, biológicos), normalmente se debe a infecciones bacterianas de la glándula mamaria. Los métodos convencionales de cultivo microbiológico no siempre consiguen identificar al agente etiológico. El método cultivo-independiente de secuenciación masiva de fragmentos largos Oxford-Nanopore aplicado a la secuenciación completa del gen 16S ARNr (ONT-16S metabarcoding) de todas las bacterias presentes en la muestra, permite la caracterización de la población microbiana (microbiota) de la leche de vaca. Las técnicas de secuenciación masiva, además, han revelado que la glándula mamaria no es estéril, como se venía creyendo, sino que alberga una microbiota compleja y aún no bien definida que contribuye a mantener la salud de la ubre. Por lo tanto, la mamitis estaría ligada a la alteración y pérdida del equilibrio (disbiosis) de esta microbiota endógena de la mama.

Con objeto de estudiar la relación entre la comunidad bacteriana de la leche y el estado sanitario de la ubre, se tomaron 281 muestras de leche en una granja de vacas de raza frisona cuyos animales fueron clasificados en 5 grupos según su historial de mamitis y número de partos: 62 vacas multíparas sin mamitis en la última lactación (G1), 63 recuperadas de un episodio previo de mamitis (G2), 38 con mamitis clínica (G3), 53 con mamitis subclínica (CMT positivo) (G4) y 65 novillas sanas (G5). De esta manera, 190 se consideraron animales sanos en el momento del muestreo (G1, G2, G5) y 91 enfermos (G3 y G4). Las muestras de leche se sometieron a un proceso de desnatado previo a la extracción del ADN (ZymoBIOMICS™ 96 MagBead DNA Kit, Zymo Research Corp.) para su análisis mediante ONT-16S metabarcoding. La preparación de librerías y secuenciación se llevó a cabo conforme el protocolo 16S Barcoding (SQK-16S024) en el equipo MinION Mk1C (ONT). Se realizó un basecalling de alta precisión (HAC) con Guppy y los adaptadores ONT fueron retirados con Porechop. La calidad de las secuencias se evaluó con FastQC y la asignación taxonómica se hizo con Kraken2 usando la base de datos Refseq en la plataforma Galaxy (https://usegalaxy.eu/). Finalmente, la tabla de abundancias se analizó en R usando diferentes paquetes (phyloseq, vegan, microbiomeMaker, cluster y clusterSim, entre otros). La definición de enterotipos (Enterotyping) se hizo siguiendo el tutorial de EMBL-EBI (https://enterotype.embl.de/enterotypes.html). El análisis de abundancia diferencial se realizó con LEfSe (LDA-score >5,0; padj=<0,05)
en la plataforma MicrobiomeAnalyst (https://www.microbiomeanalyst.ca/).

La asignación taxonómica de los 13 millones de lecturas (promedio 50.000 lecturas/muestra) permitió identificar 2.965 especies, correspondientes a 1.152 géneros. Se observó una menor riqueza y homogeneidad de la población microbiana (alfa diversidad) en las muestras de animales con mamitis clínica (G3). Respecto a la composición microbiana (beta diversidad), se observaron diferencias significativas entre los animales con mamitis clínica (G3) y cada uno de los otros grupos (PERMANOVA, F=8,18; padj=0,001).

El Enterotyping definió 6 grandes grupos (enterotipos 1-6) cuyos géneros marcadores en base al análisis de abundancia diferencial LEfSe fueron: (1) Romboutsia,
Clostridium, Clostridioides
y Paeniclostridium para el enterotipo 1
(n=103 animales; 76,7% de ellos sanos); (2) Fastidiosipila, Acetivibrio,
Mageeibacillus
y Pseudomonas en el enterotipo 2 (n=89; 68,5%
animales sanos); (3) Psychrobacter y Jeotgalicoccus en el enterotipo
3 (n=64; 67,2% animales sanos); (4) Escherichia, Klebsiella y Salmonella en el enterotipo 4 (n=14; 92,9% animales con mamitis clínica); (5) Staphylococcus
en el enterotipo 5 (n=6; 100% animales sanos) y (6) Streptococcus en el enterotipo 6 (n=5; 100% animales con mamitis clínica). Entre las muestras de animales con mamitis clínica, se diferenciaron dos situaciones claras; (i) animales con una clara disbiosis, en los que predominaba un único género bacteriano (Escherichia – enterotipo 4, Streptococcus – enterotipo 6); (ii) animales con una microbiota más diversa, similar a lo observado en el resto de grupos pero sin ningún género predominante (enterotipos 2 y 3). Las mamitis subclínicas se asocian a los enterotipos 1, 2 y 3.

Los resultados muestran que la mamitis es un proceso dinámico en el que la microbiota de la ubre está en constante cambio, evidenciando la complejidad para definir un perfil de microbiota único asociado al desarrollo de mamitis. Hay situaciones en las que un microorganismo provoca una gran disbiosis desplazando a la población endógena de la ubre y dando lugar a una mamitis. Sin embargo, lo más común es una diversidad de estados intermedios, donde la microbiota de la ubre transita entre un estado de salud y enfermedad. En estos casos, la definición clínica empleada para determinar el estado sanitario de la ubre no siempre se corresponde con la realidad microbiana ya que, como hemos visto, no existe un único perfil microbiológico que sea indicativo de mamitis. 

Financiación: Proyecto PID2019-106038RR-I00 (MCIN/AEI /10.13039/501100011033 y FEDER Una manera de hacer Europa); Ayuda predoctoral a L.U.-A. PRE2020-096275 (MCIN/AEI /10.13039/501100011033 y FSE invierte en tu futuro).

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