Identificación de variantes genéticas asociadas con producción de altos niveles de interferón-gamma en vacas de la raza frisona infectadas con Mycobacterium bovis en condiciones naturales

Alonso-Hearn Marta1, Gerard Badia-Bringué2, Maria Canive3, Patricia Vázquez4, Joseba M. Garrido5, Almudena Fernández6, Ramón A. Juste7, José Antonio Jiménez8, Oscar González-Recio9

1-NEIKER-Basque Institute for Agricultural Research and Development, Basque Research and Technology Alliance (BRTA) 2-NEIKER-Basque Institute for Agricultural Research and Development, Basque Research and Technology Alliance (BRTA)
3-NEIKER-Basque Institute for Agricultural Research and Development, Basque Research and Technology Alliance (BRTA) 4-NEIKER-Basque Institute for Agricultural Research and Development, Basque Research and Technology Alliance (BRTA)
5-NEIKER-Basque Institute for Agricultural Research and Development, Basque Research and Technology Alliance (BRTA) 6-Departamento de Mejora Genética Animal, Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA-CSIC),
7-NEIKER-Basque Institute for Agricultural Research and Development, Basque Research and Technology Alliance (BRTA) 8-CONAFE-Confederación Nacional de Frisonas Españolas
9-Departamento de Mejora Genética Animal, Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA-CSIC)

IIntroducción
La respuesta inmune de tipo celular es clave en el control de las infecciones intracelulares como la causada por Mb. Sin embargo, Mb ha desarrollado varias estrategias que le permiten sobrevivir en el interior del macrófago infectado como la inhibición de la fusión del fagosoma que contiene a la bacteria internalizada con el lisosoma. En este trabajo se analiza la posibilidad de que existan animales capaces de producir niveles más altos de IFNÉ£ y si una parte importante de esta variabilidad inter-individual podría ser debida a la genética. 

Materiales y métodos
La producción de IFNÉ£ en respuesta al derivado proteico purificado aviar (PPDAV), bovino (PPDBOV) y buffer salino PBS se midieron en sangre de 343 vacas de la raza frisona en el momento de su desvieje. De cada animal, alícuotas de 1,4 ml de sangre se estimularon con 100 µl de PBS, 100 µl de PPDAV (0.3 µg/µL) y 100 µl de PPDBOV (CZ Veterinaria® SA, Porriño, Spain) durante toda la noche a 37 ºC en un incubador con 5% CO2. Al día siguiente, las muestras estimuladas se centrifugaron, se recogieron los plasmas, y se midió el IFNÉ£ producido empleando un ELISA comercial (Bovigam TB® ELISA kit, Prionics, Schlieren, Switzerland). Las placas de ELISA se midieron en un lector de ELISA a 450 nm. Para el estudio se seleccionaron 117 animales que presentaban valores de densidad óptica (DO) en respuesta a la PPDBOV mayores que los obtenidos en las muestras estimuladas con PPDAV y con OD PPDBOV mayor que la OD de la muestra estimulada con PBS. Por otro lado, el DNA extraído de muestras de sangre periférica de estos animales se genotipó con el chip EuroG MD a través de la Confederación Nacional de Frisonas Españolas (CONAFE). Estos genotipos se imputaron posteriormente a secuencia completa obteniéndose 13.881.067 SNPs. Con los datos de OD en respuesta a la PPDBOV y los genotipos se realizó un estudio de asociación genética empleando el software GCTA v1.93.2. A partir de las variantes genéticas identificadas y sus efectos se generó un modelo genético predictivo (genomic Best Linear Unbiased Prediction, gBLUP) que permitió estimar valores genómicos de cría (genomic Estimated Breeding Values, gEBVs) para la producción de IFNÉ£ de cada animal en la población de referencia así como en una población diferente compuesta por 1.739 vacas de raza frisona. Finalmente, se analizaron las posibles correlaciones entre los caracteres incluidos en el índice de selección genética de CONAFE  y los gEBVs estimados para la producción de IFNÉ£ en la población de 1.739 animales.

Resultados
El análisis de componentes de varianza permitió determinar que la producción de IFNÉ£ en respuesta a la PPDBOV está asociada con la genética del animal (heredabilidad= 0,32), mientras que el análisis de asociación con genoma completo identificó un total de 172 polimorfismos con significación estadística (FDR≤0,05, p<5× 107), situados en 128 loci que contienen 160 genes candidatos y 16 microRNAs (miRNAs) asociados con altos niveles de IFNÉ£. Algunos de los loci identificados se solapaban con regiones asociadas previamente con la susceptibilidad a la tuberculosis bovina, índice de células somáticas y niveles de IgG. El análisis de enriquecimiento funcional realizado con los genes candidatos y miRNAs reveló un enriquecimiento significativo de la ATPasa de tipo V (ATP6V0D2/ATP6V0A2/ATP6V1G1) implicada en la fusión autofagosoma-lisosoma (autofagia), eliminación de la bacteria ingerida y control de la inflamación. Así mismo, se detectó un enriquecimiento de miRNAs (MIR29B-2/MIR29C/MIR181B-1/MIR181A-1) y genes candidatos (BCL2L11/MMP16/PDCD4/TNC) implicados en control de inflamación y remodelación de la matriz extracelular. Solo se obtuvieron correlaciones significativas entre la producción de IFNÉ£ y el índice de salud podal (ρ = 0,09) y la profundidad de la ubre (ρ = 0,10) pero de poca magnitud. 

Conclusiones
Los resultados obtenidos permiten definir un perfil inmunogenético específico asociado a los animales capaces de producir altos niveles de IFNÉ£. Así mismo, el estudio confirma que la capacidad de producir mayores niveles de IFNÉ£ no se correlaciona negativamente con otros caracteres por lo que este indicador de immunocompetencia podría ser incluido en el programa de selección genética de la raza frisona española sin comprometer a otros caracteres.

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